發布日期：2018-09-05

　　脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是一種常染色體隱性遺傳病，居兒童致死性常染色體隱性遺傳病的第 2 位。位于染色體 5q11.2~q13.3 上的運動神經元存活基因（Survival motor neuron，SMN）是 SMA 的主要致病基因。

　　人基因組有兩個緊鄰的高度同源的 SMN 基 因：端粒側的 SMN1 和著絲粒側的 SMN2，兩者僅有 5 個堿基不同。SMNl 是主要功能基因，該基因突變可導致 SMA 發病，SMN2為臨床表型的調節基因，影響病情的嚴重程度，其拷貝數增加可減輕SMA 表型。目前已知約 94％的 SMA患者為 SMNl 基因第 7 和（或）第 8外顯子純合缺失所致，少數病例可由SMN1 基因點突變或小的缺失引起。

　　SMN1 基因外顯子缺失檢測在 SMA 診斷中的意義

　　SMA 以脊髓前角運動神經元退化變性為特征，臨床表現為進行性、對稱性四肢近端和身體軀干肌肉無力、萎縮和癱瘓。根據發病年齡和肌無力嚴重程度，臨床上將 SMA 分為 I、Ⅱ和Ⅲ型，即嬰兒型、中間型和少年型，嚴重程度依次遞減。一般的，神經專科醫生根據發病年齡、臨床表現及病情進展程度進行臨床診斷，輔助檢查方法包括肌電圖、肌酶和肌肉活檢，結合家族史和 SMN1 基因分析可進行確診。肌電圖是定位診斷，特異度不高；肌酶在鑒別其他肌無力疾病中有參考意義，但對 SMA診斷無特異性；肌肉活檢由于取材的創傷性，患兒不易接受。由于 SMA患兒中約 94% 為 SMN1 基因外顯子純合缺失，因此 SMN1 基因缺失檢測對于 SMA 的診斷具有更高的靈敏度和特異性，且對不同型的 SMA 患者，SMN1 純合缺失率沒有顯著差異，也就是說 SMN1 純合缺失的檢測對于不同型 SMA 患者具有相同的臨床診斷價值；同時與有創的組織學診斷相比，基因檢測更易被接受。事實上，在歐美人群中，SMN1 基因純合缺失檢測已成為診斷和排除診斷 SMA 的首選方法。

　　SMN1 基因外顯子缺失檢測在產前診斷和篩查中的意義

　　SMA 在 人 群 中 的 發 病 率 為 1/5 000~1/10 000，群體攜帶者頻率為 1/35~1/50，是出生缺陷的高危因素。由于該病嚴重危害人類健康，且基因位點明確，因此極有必要進行SMA 攜帶者的人群篩查。通過 SMN1基因外顯子雜合缺失突變的檢查可確認無癥狀的攜帶者。當夫妻雙方均為攜帶者時，可對其進行遺傳咨詢，評估生育患兒的遺傳風險，并可以通過產前診斷技術降低人群中 SMA 患兒的出生率。在歐美等國家很早就建議在普通人群中進行 SMA 攜帶者的篩查。

　　但在 SMA 患兒臨床診斷和 SMA攜帶者篩查中，對 SMN1 基因外顯子缺失檢測的要求是截然不同的，前者僅需準確檢測出 SMN1 基因外顯子純合缺失，后者則需要鑒別 SMN1 基因外顯子雜合缺失。

　　SMN1 基因缺失檢測試劑的現狀

　　目前，SMN1 基因外顯子缺失檢測試劑較為缺乏。臨床檢驗實驗室較為公認的方法是 PCR 結合限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）的方法，但該方法操作較為繁瑣，且重復性差，不利于標準化，不易推廣。這種方法只能檢測出純合缺失，無法確認雜合缺失。

　　荷蘭的 SMA MLPA 檢測試劑可對待測靶序列進行半定量分析，因此既可檢測純合缺失，亦可確認雜合缺失。在國內外已有多篇文獻報道采用該方法進行 SMA 患者診斷和 SMA 攜帶者篩查。但該產品目前仍為“僅用于研究”的試劑，尚未按照體外診斷類醫療器械上市（98/79/EC）。

　　2015 年底，CFDA 批準了第一項SMN1 缺失突變檢測試劑上市。該產品采用多重實時熒光 MGB-TaqMan探針 PCR 法，以人基因組單拷貝基因 RPP40 為內參基因，對 SMN1 基因第 7 外顯子和第 8 外顯子拷貝數進行相對定量檢測，用于脊肌萎縮癥（SMA）患者的體外輔助分子診斷。SMN1 基因外顯子缺失檢測的難點之一在于排除高同源性基因 SMN2 的干擾，特別是對于 SMN2 高拷貝數的受試者，需保證結果的準確可靠。該產品通過對實時熒光 PCR 相對定量、絕對定量技術進行系統整合，并在反應體系中加入特定化學組份，以抑制PCR 引物 3’端的胞嘧啶（C）與胸腺嘧啶（T）的錯配，增加 PCR 擴增的特異性，從而有效控制 SMN2 基因非特異性擴增對檢測結果的影響，準確檢出高拷貝數 SMN2 樣本中 SMN1基因第7外顯子和第 8外的缺失情況。

　　鑒于國內外尚無任何按照體外診斷試劑批準上市的SMA 分子診斷產品，因此臨床試驗方案中依據 EMQN 關于《SMA 分子診斷最佳實踐指南》，采用了國內外SMA 體外輔助分子診斷領域公認的PCR-RFLP 法作為對照方法。臨床試驗共完成 1069 例，其中正常對照組777 例，SMA 病例組 292 例，統計分析結果顯示申報產品與對比方法檢測結果的一致性為 100%（95% 置信區間：99.66%-100%）。 此外，9747例正常成年人大樣本中目標外顯子△△ Ct 分布范圍的調查亦顯示，該產品的純合突變判斷界值設置合理。

　　該試劑目前批準的預期用途僅包含純合缺失的檢測，尚不能用于雜合缺失的檢測。因此無法用于 SMA攜帶者的篩查。這是該產品的缺陷之一。但事實上該產品在設計上已考慮到 SMA 攜帶者的檢測。該產品的檢測原理是以待測樣本中目標外顯子熒光信號 Ct 值與內參基因熒光信號 Ct 值之差（△ Ct_s），與正常對照品三個梯度稀釋品中目標外顯子熒光信號 Ct 值與內參基因熒光信號 Ct 值之差的平均值（△ Ct_a）之差，即△△ Ct，作為待測樣本中目標外顯子拷貝數檢測變量（△△ Ct= △ Ct_s - △ Ct_a）。 依據實時熒光定量PCR 相對定量的基本數學原理推導得到申報產品檢測變量△△ Ct 的計算公式，依據這一計算公式可推導出純合缺失、雜合缺失和野生型的△△ Ct 理論值（或范圍）；再結合目標外顯子與內參基因擴增效率差異以及 SMN2 不同拷貝數的影響，可對上述△△ Ct 理論值進行優化；結果顯示純合缺失、雜合缺失和野生型的△△ Ct 值（或范圍）之間可設置合理的判斷界值，因此理論上該產品可分別檢測出三種基因狀態。但鑒于生產企業對雜合缺失與野生型之間的判斷界值研究尚不透徹，再加上缺乏可判定雜合缺失的對比方法等其他困難，本次注冊申請的預期用途僅限于檢測純合突變，即 SMA 患者輔助診斷。

　　小結

　　綜上，SMN1 基因外顯子缺失檢測在 SMA 疾病診斷和 SMA 攜帶者篩查中具有重要的臨床價值。然而到目前為止，受到技術水平的限制，相關的體外診斷試劑比較缺乏，特別是可用于 SMA 攜帶者篩查的雜合缺失檢測，尚無適合的體外診斷試劑上市。（審評六部 何靜云 供稿）

　　參考文獻：

　　【1】王佶等.脊髓性肌萎縮癥 SMN1 和SMN2 基因拷貝數變異分析.中國循證兒科雜志 ,2013年03期

　　【2】張文慧，曹延延等.運用 MLPA 技術分析脊髓性肌萎縮癥患兒 SMN1 基因的部分缺失.中華醫學雜志，2015.95（6）

　　【3】江雨，周裕林, 脊髓性肌萎縮癥SMN1 基因攜帶者篩查技術研究進展.中國產前診斷雜志（電子版）2013,5(02): 34-39

來源：中國器審